中國科學院物理研究所
北京凝聚態物理國家研究中心
SM4組供稿
第66期
2020年08月27日
單分子研究揭示DNA同源重組中鏈交換擴展的分子機理

  基因的同源重組是由重組酶介導的、發生在相同或相近的兩條DNA鏈之間的鏈交換,對于維持遺傳穩定性和生物多樣性具有重要意義。同源重組現象的發現已有幾十年歷史,同源識別和鏈交換是同源重組過程中最重要的步驟,但由于其反應中間產物停留時間短并且狀態復雜,常規方法難以捕捉,因而其分子機理仍十分模糊。

  最近,中國科學院物理研究所/北京凝聚態物理國家研究中心軟物質實驗室SM4組的徐春華副研究員、陸穎副研究員以及黃星榞博士等,運用單分子磁鑷和熒光成像技術,通過巧妙的實驗設計,捕捉到同源重組鏈交換的中間態,在體外再現了鏈交換的步進過程,并推測出過渡態結構的存在,建立了RecA介導的同源重組的行波模型,闡述了同源重組中序列識別和鏈交換的分子過程。

  作為重組酶的代表,RecA幾乎能夠獨立完成同源重組中的鏈交換過程。RecA介導的同源重組可簡略描述為:發生雙鏈斷裂的DNA末端在相關蛋白的作用下,形成3??單鏈突出,這段單鏈可以被RecA纏繞形成螺旋絲狀結構(核蛋白絲nucleoprotein filament);核蛋白絲入侵到雙鏈DNA中,搜尋與之同源的序列并發生鏈交換。核蛋白絲中的入侵鏈(I鏈)替換同源雙鏈DNA中的被替換鏈(O鏈),與互補鏈(C鏈)形成新的雙鏈,如圖1A左圖所示。在本研究中,研究人員使用發卡結構DNA(hairpin DNA)與RecA形成的核蛋白絲來模擬同源重組的擴展過程,如圖1A右圖所示(虛線框內部分與左圖虛線框相對應),核蛋白絲在發卡DNA開口處發生鏈交換,每一步打開一定數量的堿基對,體現為磁球高度的步進式變化,以此在體外再現鏈交換的步進過程。

  在研究中,他們意識到鏈交換反應的中止或許能夠體現出中間態的信息,從而得到更多鏈交換反應的細節。因此,研究人員設計了一系列包含不同錯配堿基的DNA,從單分子尺度上觀察鏈交換反應的動力學現象。他們意外地發現鏈交換的終點竟然不在界面(錯配序列與同源序列的交界處定義為界面),而是被完全錯配序列阻擋于界面之前9 bp的位置(圖1B和C)。

圖1.用單分子磁鑷觀察鏈交換反應。(A)使用120 bp的發卡DNA來模擬供體雙鏈DNA。(B)鏈交換反應的典型曲線,部分序列為錯配堿基。(C)鏈交換反應長度的分布。藍色點劃線表示界面的位置,紅色虛線表示界面前9 bp的位置。

  邏輯上講,同源序列比對過程應發生在鏈交換反應之前,且必然越過界面,否則核蛋白絲無從得知界面后的DNA序列是否同源。因此在界面前9 bp到界面之間的9個同源堿基也應被比對過。那么,為什么這9個堿基沒有發生鏈交換反應?這個結果暗示了鏈交換反應中,在序列比對態與已換鏈態之間存在著一個9 bp的過渡結構。由于這個結果過于意外,研究人員用酶切保護實驗和熒光共振能量轉移(FRET)實驗(圖2)兩種方法進行了進一步證實。此外,FRET實驗提供了雙鏈DNA結構的重要的信息,未參與反應的雙鏈DNA會以接近垂直的角度從核蛋白絲中彎折出來。

圖2.使用FRET實驗研究鏈交換反應。(A)實驗示意圖。當反應結束時雙鏈DNA從核蛋白絲中彎折出來。藍色點劃線表示界面的位置,紅色虛線代表界面前9 bp的位置。(B)左側為典型的FRET實驗曲線,后18個堿基為完全錯配序列。右側展示的為是終態FRET值的統計分布。(C)與(B)相同,后18個堿基為50%錯配序列。

  通過磁鑷和FRET實驗,研究人員還測量了鏈交換和同源序列比對的步長,他們發現雖然3 bp仍然是鏈交換的基本單位,但同源序列比對與鏈交換的步長都更傾向于以3 bp的整數倍發生,最概然的步長均為9 bp。同時,前面提到的過渡結構也為9 bp。結合實驗和理論,研究人員建立了一個鏈交換模型,在這個模型中鏈交換過程像行波一樣推進:在最前端,雙鏈DNA會以9 bp為步長與核蛋白絲中的單鏈進行同源序列比對,后面緊跟著一個9 bp的過渡態,最后則是已經發生鏈交換的雙鏈DNA,反應模型如圖3所示。

圖3.同源重組過程的步驟分解。(A-D)同源序列間的鏈交換過程,C鏈分為3個部分,已換鏈態(紅色),過渡態(藍色)以及序列比對態(綠色)。(E-H)同源重組過程被非同源序列阻擋的情況。同源比對態跨過界面位置。I鏈的同源序列表示為黃色,非同源部分為黑色。核蛋白絲上的RecA蛋白為了展示方便而隱去。

  該工作以“Mismatch sensing by nucleofilament deciphers mechanism of RecA-mediated homologous recombination”為題,發表于Proc. Natl. Acad. Sci. USA(DOI:10.1073/pnas.1920265117)。此工作得到了國家自然科學基金、中國科學院前沿科學重點研究計劃、中國科學院青年創新促進會以及王寬誠教育基金的支持。
    文章鏈接:https://www.pnas.org/content/early/2020/08/10/1920265117